Alamar Blue 阿爾瑪藍細胞增殖及毒性檢測試劑說明書

產品描述

  阿爾瑪藍（Alamar Blue）是一種細胞活力檢測試劑，包含一種具細胞膜滲透性、無毒性且弱藍色熒光的指示劑，即刃天青 （resazurin）。自從1993年開始刃天青就作為一種值得信賴和可靠的試劑被引用。阿爾瑪藍是MTT（噻唑蘭）的有效且無毒 替代物。阿爾瑪藍能定量檢測人、哺乳動物、細菌、真菌和支原體細胞的增殖情況，也能用于細胞因子生物活性、細胞活力分 析、體外細胞毒性確定以及細胞生長監測。

工作原理

刃天青（resazurin）是一種氧化還原（REDOX）指示劑，根據細胞代謝還原情況發生顏色變化。氧化態的刃天青呈紫藍色且基本無熒光，其還原態產物試鹵靈（resorufin）轉變為粉紅色且高度熒光，產生的熒光強度與呼吸活細胞數量呈正比。通過檢測 ，呼吸過程中氧化水平，阿爾瑪藍用作一種定量檢測細胞活力和毒性的直接指示劑。阿爾瑪藍的顏色變化可通過普通分光光度計 檢測吸光度變化，檢測波長為570nm，參考波長為600nm；阿爾瑪藍的熒光變化可通過熒光光度計檢測，激發波長在 530~560nm之間，發射波長為590nm。

操作說明

一、制作標準曲線（測定最佳孵育時間和細胞數量）

1. 每孔加入100微升細胞懸液（對數生長期細胞），對細胞計數。按比例依次用培養基等比稀釋成一個細胞濃度梯度，一般要做3-5個細胞濃度梯度，每個濃度建議3-6個復孔。注：設置陰性對照：細胞培養基中不加入細胞；陽性對照：100微升100%還原型Alamar Blue（不含細胞）。

2. 每孔加入10微升Alamar Blue，陽性對照孔中加入10微升無菌的超純水。

3. 放入細胞培養箱內培養（37℃,5% CO2）一定時間，培養基的顏色由靛青藍開始變成粉紅色就可以進入下一步。

4. 推薦用熒光分光光度計檢測，激發光波長在530-560 nm之間，發射光波長為590 nm。

5. 普通分光光度計在570nm測定吸光度，參考波長600nm。也可用570/630 nm和540/600 nm替代。

6. 繪制標準曲線。以細胞數量或孵育時間為橫坐標（X軸），Alamar Blue還原率為縱坐標（Y軸）。根據此標準曲線可以測定出適合的細胞數量或孵育時間（使用此標準曲線的前提是實驗的條件要一致）。

a）公式 1：通過吸光值來計算還原率

Alamar Blue 還原率（％）=[（E600×A570）-（E570×A600）]/[(E570′×C600)-（E600′×C570）] ×100；

E600=氧化態 Alamar Blue 在 600nm 波長的消光系數；

E570=氧化型 Alamar Blue 在 570nm 波長的消光系數；

A600=檢測孔在 600nm 波長的吸光值；

A570=檢測孔在 570nm 波長的吸光值；

E570′=還原態 Alamar Blue 在 570nm 波長的消光系數；

E600′=還原態 Alamar Blue 在 600nm 波長的消光系數；

C570=陰性對照孔在 570nm 波長的吸光值（不加細胞的培養基+Alamar Blue）；

C600=陰性對照孔在 600nm 波長的吸光值（不加細胞的培養基+Alamar Blue）；

b）公式 2：通過熒光值來計算還原率

Alamar Blue 還原率（％）=（實驗組 FI 590-陰性對照組 FI 590）/（100%還原態 Alamar Blue 陽性對照 FI 590-陰性對照組 FI 590）×100

FI 590=590nm 發射波長（560nm 激發波長）下的熒光強度；

6. 繪制在每個特定細胞密度或孵育時間 Alamar Blue 的還原率。

a）對確定最佳細胞密度的實驗，以細胞密度的對數（log）為 x 坐標，Alamar Blue 還原率為縱坐標；

b）對確定最佳孵育時間的實驗，以孵育時間為 x 坐標，Alamar Blue 還原率為縱坐標；

c）根據以上曲線圖來確定最佳細胞密度或孵育時間。

二、細胞毒性和細胞增殖檢測

1. 每孔加入100微升細胞懸液（對數生長期細胞），對細胞計數。建議細胞數量為104/ml，具體每孔需要的細胞數量，需根據細胞類型決定。

2. 細胞中加入待檢測藥物，為檢測藥物對細胞增殖的作用，請設置合適的對照組，包括刺激細胞和非刺激細胞。

3. 混勻，放入細胞培養箱內孵育（37℃,5% CO2）一段時間。

4. 每孔加入10微升Alamar Blue。陽性對照孔中加入10微升無菌的超純水。

5. 放入細胞培養箱內孵育（37℃,5% CO2）4-8h，最佳孵育時間取決于細胞類型。培養基的顏色由靛青藍開始變成粉紅色就可以進入下一步。

6. 推薦用熒光分光光度計檢測，激發光波長在530-560 nm之間，發射光波長為590 nm。

7. 普通分光光度計在570nm測定吸光度，參考波長600nm。也可用570/630 nm和540/600 nm替代。

a）公式 3：通過吸光值來計算還原度的變化百分比

Alamar Blue 還原度變化百分比（％）=[（E600×A570）-（E570×A600）]/[( E600×P570)-（E570×P600）] ×100

E600=氧化態 Alamar Blue 在 600nm 波長的消光系數；

E570=氧化態 Alamar Blue 在 570nm 波長的消光系數；

A600=檢測孔在 600nm 波長的吸光值；

A570=檢測孔在 570nm 波長的吸光值；

P570=陽性對照孔在 570nm 波長的吸光值（不含待測藥物的細胞+ Alamar Blue）

P600=陽性對照孔在 600nm 波長的吸光值（不含待測藥物的細胞+ Alamar Blue）

結果判斷：假如 Alamar Blue 還原度變化百分比（％）=62%，說明相對于對照孔，檢測孔 Alamar Blue 的還原變化值為 62%，換句話而言，相對于對照孔，38%的檢測孔細胞生長受到抑制。

b）公式 4：通過熒光值來計算還原度的變化百分比

Alamar Blue 還原度變化百分比（％）=（實驗組 FI 590/陰性對照組 FI 590）×100 FI 590=590nm 發射波長（560nm 激發波長）下的熒光強度；

結果判斷：假如 Alamar Blue 還原度變化百分比（％）=25%，說明相對于對照孔，檢測孔 Alamar Blue 的 還原變化值為 25%，換句話而言，相對于對照孔，75%的檢測孔細胞生長受到抑制。

運輸與保存方法

保存：4℃避光保存，至少一年有效。運輸：冰袋運輸。

注意事項

1） 還原態的 Alamar Blue 在水或水溶性緩沖液如 PBS 中很不穩定，但在培養基內非常穩定。為了確定特定實驗還原態 Alamar Blue 的吸光度/熒光值，需準備 100%還原態 Alamar Blue 試劑：將 Alamar Blue與細胞培養基（含血清）按照 1:10 的比例混合，121℃高壓滅菌 15min 即可。由于熒光值定義比較隨意，儀器不同熒光值都可能發生變化，因此，測定 100%還原態 Alamar Blue 熒光值時必須要和樣本測定使用相同的儀器和培養基。

2） 適宜的細胞密度能夠增加檢測靈敏度。對于 96 孔板，建議每孔接種 100μl 細胞，細胞濃度范圍：貼壁細胞為 100-10,000 個/孔，懸浮細胞在 2,000-50,000 個/孔，以培養基為空白對照。對于 384 孔板，細胞濃度和接種量均減半。

3） 影響細胞對 Alamar Blue 反應的兩大變量為孵育時間和鋪板密度，建議實驗前需先摸索優化這兩個因素。細胞密度過高或孵育時間過長都會導致繼發性還原反應，紅色產物停止增加并開始衰減，導致吸光度/熒光水平明顯下跌并伴隨紅色消失。

4） 微生物污染會還原 Alamar Blue。因此對被污染細胞使用 Alamar Blue 檢測會引起錯誤結果。

5） Alamar Blue 可以用分光光度計或熒光計檢測，但熒光靈敏度高，實驗誤差小，推薦熒光檢測。

6） 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。