Collagenase V膠原酶V型

膠原酶（Collagenase）是一種蛋白酶，一種肽鏈內切酶，能夠特異性的識別Pro-X-Gly-Pro序列（該序列高頻率出現在膠原中，很少發現于其他蛋白中）并切割該序列中性氨基酸（X）和甘an酸（Gly）之間的肽鍵。許多蛋白酶都能水解單鏈且變性的膠原多肽，但膠原酶是唯yi一種可以降解具有三股超螺旋結構的天然膠原纖維的蛋白酶，這種膠原纖維廣泛存在結締組織內。

本品來源于溶組織梭菌（Clostridium histolyticum），是一種酶粗提物，不僅含有膠原酶（更準確的稱法為梭菌蛋白酶A（clostridiopeptidase A）），能夠降解天然膠原和網狀纖維。還含有其他的一些蛋白酶、多糖酶、脂酶等，分別能夠有效水解結締組織和上皮組織細胞外基質內的其他蛋白，多糖和脂質，使得本品非常適用于組織消化。

目前商業化提供的細菌膠原酶主要根據膠原酶活性的差異，分為四種類型：膠原酶I型，II型，III型和IV型，在應用上有所偏向：

1）膠原酶I（Type I Collagenase）：含有比較均勻的各種酶活力（包括膠原酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶、yi蛋白酶活性）。通常用作上皮細胞、肝、肺、脂肪和腎上腺組織細胞的制備；

2）膠原酶II（Type II Collagenase）：含有更高的梭菌蛋白酶活性，通常用于心臟、骨、肌肉、胸腺和軟骨等組織來源細胞的制備；

3）膠原酶III（Type III Collagenase）：含有較低的蛋白酶活性，常用于乳腺細胞的制備；

4）膠原酶IV（Type IV Collagenase）：含有低yi酶活性，通常用于胰島細胞的制備，或者需要維持受體完整性的細胞制備實驗。

本品為V型膠原酶，≥125 CDU/mg solid（CDU = collagen digestion units），具有更高的膠原酶活性和酪蛋白酶活性，更低的yi酶水平以降低對細胞膜蛋白的損傷，適用于胰腺小島細胞和結締組織細胞的分離。

酶活力單位定義

      在37℃，pH7.5 的條件下，5 h內水解膠原產生相當于1 µM L-亮an酸的酶量定義為1個酶活力單位。

運輸及保存條件

室溫運輸。4℃避光保存，2年有效。儲存液-20℃避光凍存。

使用方法

1. 膠原酶儲存液的配制

向每管100 mg的膠原酶中加入100 µL的含Ca2+、Mg2+的HBSS（Hank’s平heng鹽溶液，含Ca2+、Mg2+），輕輕旋渦震蕩使其充分溶解，制備成1g/mL（即1000×）的儲存液。然后用低蛋白結合性的0.22 μm的濾膜過濾除菌，分裝成小份量，然后于-20 °C避光凍存。

使用前于冰上解凍，避免反復凍融。其用于組織和細胞分散的常用濃度為：0.5-2.5 mg/mL，用于軟骨消化的常用濃度為1-2 mg/mL，需要根據特定的實驗條件或者參考相應的文獻資料確定所需的最佳工作濃度。

2．組織的分離

1. 使用無菌手術dao或剪刀將組織切成3-4 mm大小的組織塊；

2. 利用含Ca2+、Mg2+的HBSS洗滌組織塊數次；

3. 加入足量的含Ca2+、Mg2+的HBSS，使其浸沒組織塊，并加入膠原酶至需要工作濃度；

4. 于37℃孵育4-18 h。消化時使用水平搖床以及用3 mM的CaCl2補充消化可以提高消化效率。

5. 已分散開的細胞可使用不銹鋼或尼龍網篩篩得，收集備用。未wan全解離的組織另外添加適量的新鮮膠原酶工作液于37℃繼續孵育；

6. 利用不含膠原酶的HBSS洗滌收集的細胞數次；

7. 細胞培養液重懸上述細胞，利用自動細胞計數器或其他方法計算活細胞密度。

8. 于細胞培養皿上利用合適細胞培養基接種細胞。

3． 器官灌注

1. 向37℃預熱的含Ca2+、Mg2+的HBSS中加入膠原酶，另添加3 mM的CaCl2有助于提高分離效率；

2. 按照已優化的速率對相應的器官灌注膠原酶工作液；

3. 將上述過程中回收的灌注液流經不銹鋼或尼龍網篩，從而將已解離的細胞或小片段組織塊與較大團塊分離開來，未充分解離的組織需利用新鮮膠原酶工作液于37℃進一步孵育；

4. 利用不含膠原酶的HBSS洗滌收集的細胞數次；

5. 細胞培養液重懸上述細胞，利用自動細胞計數器或其他方法計算活細胞密度。

6. 于細胞培養皿上利用合適細胞培養基接種細胞。

注意事項

    1. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

    2. 本產品主要用于科研領域，不宜用于臨床診斷或其他用途。